核内構造体と液液相分離

はじめに

核内構造体と液液相分離

真核生物では、DNAが核に閉じ込められています。

とはいえ、核内はDNAの一様な水溶液という訳ではなく、核内構造体というタンパク質とRNAの凝集体（集まったもの）があります。

核内構造体の中でもよく研究されているのが核小体で、翻訳の主役となるリボソームを合成する役割があります。

核外の機能単位であるオルガネラは脂質膜によって区画化されています。

一方、核内構造体は脂質膜によって区画化されていないので、無膜オルガネラ（Membraneless Organelle、または、 MLO）と呼ばれたりもします。

核の外にもタンパク質とRNAの凝集体は存在していますので、それと合わせて細胞内凝集体と言われます。

たとえば、ドレッシングのような水と油の二成分系では、機械的に振って混ぜたとしても、時間がたつにつれて水を主成分とする領域と油を主成分とする領域に分かれてしまいます。

この現象を液液相分離（Liquid-liquid phase separation, LLPS）と言います。

水を主成分とする領域も油を主成分とする領域も液体（液相）ですからね。

２つ（以上）の液相に分かれてしまうので、液液相分離です。

細胞内凝集体は、液液相分離で形成されると考えられています[1,2]。

2017年ころから、分子生物学で液液相分離が非常に流行りました[1-4]。

私は当時、液液相分離の何が面白いのか全然わかりませんでした。

というのも、液液相分離は、統計力学やソフトマター物理学で過去に研究しつくされてきた、分かっていることであり、研究要素がほとんどないからです。

しかし、廣瀬先生や山崎さん（阪大）と出会い、核内構造体に限って言えば、非常に新しいことがあることに気付きました。

アーキテクチャRNA（arcRNA）

21世紀初頭までに、ヒトゲノムの塩基配列が解読されました。

ヒトゲノムを解読して、生成されるタンパク質がすべてわかれば、ヒトという生物が分かることが期待されたのですが、結局のところ、塩基配列を解読するだけではゲノムは分からないということが分かっただけでした。

なぜならば、真核生物のゲノムは、タンパク質をコードしている配列（エクソン）だけでなく、タンパク質をコードしていない配列（イントロン、または、非コード領域）があります。

ヒトゲノムのほとんどはイントロンであり、マウスとの違いもほとんどがイントロンだったからです。

しかも、非コード領域も転写されていて、RNAが生成されています。

タンパク質にならないRNAを非コードRNAと呼びます。

廣瀬先生たちは、非コードRNAの中には、核内構造体の足場となるようなものがあることを発見され、アーキテクチャRNA（arcRNA）と名付けられました[5]。

核内のRNAは、一般的に裸ではなく、RNA結合タンパク質（RNA-binding proteins、または、RBP）と複合体を形成しています。

RNAとRBPの複合体を、リボヌクレオタンパク質（ribonucleoprotein、または、RNP）複合体と言います。

核内には様々なRBPがあり、RNAのどの部分ににどのRBPがつくかということは、RNAの配列に依存していると考えられていますが、完全には理解されていません。

RBPの中には、濃度を濃くすると液液相分離を示すものもあります。

液液相分離を示すようなタンパク質は、天然編成領域（intrinsically disordered region、または、IDR）という、決まった形を取らない領域を持つ傾向があります。

多数のタンパク質のIDRがゆるく相互作用することによって液液相分離が起こります。

このような相互作用を多価相互作用（multi-valent interaction）と言います。

この話を聞いた時、核内構造体の形成が非常に面白い問題であることに気付きました。

なぜRNAが足場となっていると核内構造体が急に面白くなるかということを説明するために、まず次の節で統計力学における液液相分離の理解についてお話ししたいと思います。

相分離の物理学

相分離はなぜおきるか

液液相分離自体は、本当に学部の物理化学の講義で習うくらいの基本的なことです。

水とタンパク質（1種類）の二成分系を考えるとき、それぞれの分子の熱運動と相互作用を考えます。

まず、分子の熱運動はランダムな運動ですので、水分子とタンパク質を混ぜるように寄与します。

統計力学では、分子の熱運動をエントロピーという量で表します。

エントロピーは、場合の数の対数にボルツマン定数をかけたものです。

分子が完全にそろった状態（水とタンパク質が完全に分かれている状態）の実現の仕方（場合の数）は１つですが、ランダムな状態（水とタンパク質が混ざった状態）の実現の仕方（場合の数）は大きくなります。

場合の数が大きいほどその状態になる確率は高くなります。

場合の数が大きいほどその状態になる確率が高くなるので、エントロピーは大きいほど安定になります。

熱運動がランダムであることに注目し、ランダムさをカウントしているわけですね。

熱運動のエネルギー（熱エネルギー）は、ボルツマン定数$k_{\rm B}$に$T$絶対温度をかけたものとなり、27${}^\circ {\rm C}$だと$k_{\rm B}T\simeq4\times 10^{-21}$ Jとなります。

一方、相互作用には、水分子と水分子の相互作用、タンパク質とタンパク質の相互作用、水分子とタンパク質の相互作用の３つがあります。

タンパク質とタンパク質の相互作用は、前節で紹介した多価相互作用ですね。

水-水相互作用の大きさとタンパク質-タンパク質相互作用の大きさの平均から水-タンパク質相互作用の大きさを引いたものが実効的な相互作用の大きさとなります。

この実効的な相互作用を熱エネルギー$k_{\rm B}T$で割ったものを$\chi$と書くことが多く、相互作用パラメータと呼ばれます。

つまり、熱エネルギーに対する多価相互作用エネルギーの大きさですね。

ギリシャ文字$\chi$は、”カイ”と読みます。

相互作用パラメータは、$\chi$（カイ）パラメータ、または、Flory-Hugginsパラメータと呼ばれることもあります。

熱エネルギーが相互作用エネルギーよりも大きい時には水とタンパク質が混ざった状態が安定になります。

一方、相互作用エネルギーが熱エネルギーよりも大きい時に、水を主成分とする領域とタンパク質を主成分とする領域に相分離します。

核内構造体が面白いと思う理由

エントロピーの寄与を加えてエネルギーの概念を拡張したものを自由エネルギー（free energy）と言います。

自由エネルギーは、系の安定性を定量化したものだと思ってください。

自由エネルギーが小さければ小さいほど、系は安定です。

生成したタンパク質を水に溶かしてずっと待つと、分子レベルでは熱運動が起きますがマクロには変化が起きない熱平衡状態に落ち着きます。

つまり、熱平衡状態が一番安定な状態になるので、自由エネルギーは最小になります。

逆に、自由エネルギーが分かっていれば、それが最小になる状態を見つけると、それが熱平衡状態に対応しています（自由エネルギー最小原理）。

この状態では物質の変化はありません。

ほとんどの場合、自由エネルギー最小原理を使って相分離を予言します。

それでは、核内構造体形成の理論を作るとき、自由エネルギー最小原理を使えるでしょうか。

arcRNAはRNAですので、核内のDNAの転写によって生成されます。

転写という生化学反応によって、物質の変化が起こり続けているので、熱平衡状態からずらされ続けているのです。

つまり、熱平衡状態での相分離を予言することができる自由エネルギー最小原理は、arcRNAを足場としている核内構造体には使えないのです。

核内構造体の面白さは、相分離を予言するスタンダードな原理が使えないことにあると思います。

高分子溶液の相分離－Flory-Hugginsの理論

これまでは、平衡状態におけるタンパク質と水の相分離については、自由エネルギー最小原理を使って解析できることをお話ししました。

次に、高分子の相分離についてお話しします。

高分子は、同じ繰り返し単位（モノマー）が結合して合成される化合物です。

タンパク質も、（厳密には種類が違いますが）アミノ酸が結合して合成されるので、それ自体も高分子といえば高分子です。

これまでは、タンパク質自体をひとつのモノマーとして扱いました。

その意味では、少しマクロな視点での理論ということになります。

アクチンフィラメントや微小管のようにタンパク質がつながったものが対応する高分子になります。

高分子ではモノマーがつながっているという拘束条件が課されるため、混ざった状態であっても取りうる場合の数が（モノマーがバラバラな時と比べて）小さくなります。

熱運動するにしても、つながっているので一緒にしか動けないということですね。

そのため、熱運動を表していたエントロピーが小さくなり、バラバラの時と比べて相分離しやすくなります。

ここで「相分離しやすい」というのは、より低い濃度で相分離すると思ってください。

もっと正確なことは、次の節でお話しします。

すごく端的に言うと、高分子ではモノマーがつながっていて、すでにモノマーが近くにいるので、バラバラの時と比べて相分離しやすいということです。

この理論を発見者の名を冠してFlory-Hugginsの理論と言います[6,7]。

相分離に関わる物性パラメータ―相互作用パラメータ$\chi$と体積分率$\psi$

ここで少し定量的な話をします。

少し踏み込んだ話題ですので、概略だけをつかみたい方はこの節を飛ばしてもらって構いません。

簡単のために、タンパク質と水の系に戻りましょう。

相分離は、相互作用エネルギーが熱エネルギーよりも大きくなった時に起こります。

相互作用エネルギーと熱エネルギーの比を、相互作用パラメータ$\chi$と言いました。

相互作用パラメータ$\chi$は、非常にシンプルな場合は（熱エネルギー$k_{\rm B}T$で割っているので）、物質によって決まる２つの定数$a$と$b$をつかって、

のような形になります。

しかし、場合によっては、タンパク質間相互作用の中にIDRの形の取り方や、イオン分布、水和などが絶対温度に依存するために、絶対温度の複雑な関数になっていることもあります。

つまり、温度を変えると、相互作用エネルギーと熱エネルギーのバランスが変わります。

そのため、実験的には温度を変える操作になるのですが、理論的には相互作用パラメータ$\chi$を使った方が便利です。

後でその関係を測定してやる必要はありますが、やってやれないことはありません。

あと、相分離に関わるのはタンパク質濃度です。

タンパク質濃度に、タンパク質１分子当たりの体積をかけたものをタンパク質の体積分率$\psi$と言います。

$\psi$はギリシャ文字で、”プサイ”と読みます。

溶液中でタンパク質が占めている体積の分率ですね。

タンパク質溶液は、タンパク質、または、水によって敷き詰められているので、濃度よりも体積分率で表した方が便利です。

というのは、1からタンパク質の体積分率$\psi$を引いた量は、水の体積分率になるからです。

相図

ここも踏み込んだ話題ですので、概略だけをつかみたい方はこの節を飛ばしてしまって構いません。

物理学で相分離というと、必ず出てくるのが相図です。

相図とは、相互作用パラメータ$\chi$とタンパク質体積分率$\psi$を軸にとったとき、どの$\chi$と$\psi$の組み合わせの状態で相分離が起きるかということを図示したものです。

みなさんも、高校で物質の三態を習い、温度と圧力を軸として、どの組み合わせで物質が気体、液体、固体になるかということを示した相図（状態図と言ったりもします）を見たことがあると思います。

その代わりに、相互作用パラメータ$\chi$とタンパク質体積分率$\psi$を軸として

相分離の相図には、２つの特徴的な曲線があります。

１つはバイノーダル曲線、もう１つはスピノーダル曲線です。

相分離は、バイノーダル曲線で囲まれた領域（$\chi$と$\psi$の組み合わせ）で起きます。

スピノーダル曲線で囲まれた領域では、一様な状態が不安定になります。

バイノーダル曲線とスピノーダル曲線の間の領域では、相分離した方が比較的安定ではあるが、一様な状態が不安定という訳ではない状態（準安定状態）です。

バイノーダル曲線とスピノーダル曲線が交わる点を臨界点（critical point）と言います。

臨界点における相互作用パラメータを$\chi_{\rm c}$とすると、相互作用パラメータ$\chi$が$\chi_{\rm c}$以上でないと相分離が起きないことになります。

熱平衡状態なので、温度（というか、相互作用パラメータ$\chi$）がどこでも一様である場合を考えます。

相互作用パラメータが$\chi$である場合のバイノーダル曲線上の値を$\psi _1^{\rm b}$と$\psi_2^{\rm b}$とすると、体積分率が$\psi_1^{\rm b} <\psi <\psi_2^{\rm b}$の間で相分離が起きることになります。

相分離が起こるのは、体積分率が$\psi_1^{\rm b}$である状態と体積分率が$\psi_2^{\rm b}$である状態が、混ざった状態と比べて安定だから（自由エネルギーが小さいから）です。

そのため、仕込んだタンパク質がどのような量であっても、相分離によって形成される水を主成分とする領域とタンパク質を主成分とする領域におけるタンパク質体積分率は、それぞれ、$\psi_1^{\rm b}$と$\psi_2^{\rm b}$になります。

仕込んだタンパク質の量を変えると、分離した２つの領域におけるタンパク質の体積分率が変わる代わりに、分離した２つの領域それぞれの体積が変わります。

これが、高分子になると、つながっているモノマーの数を大きくするにつれて、臨界点での相互作用パラメータ$\chi_{\rm c}$が小さくなり、相分離が起こる最小の体積分率$\psi_1^{\rm b}$も小さくなります。

相分離に必要な相互作用パラメータと体積分率が小さくなるという意味で、高分子にすると相分離しやすくなるのです。

相分離の統計力学を学ぶためにお勧めな本

統計力学を初歩から解説した分かりやすい本に久保亮五の本があります[8]。

この本には、最後の節に相分離の統計力学（特にBragg-Williams理論）が載っています。

合金を例にとっていますが、エッセンスは液液相分離と同じです。

私は、イスラエルに留学中にSafran先生に相分離を教えてもらったので、Safran先生の本も紹介しておきます[9]。

統計力学は既知のものとしていますが、相分離に関しては非常に詳しく書かれており、スタンダードな相図の予言（下記）だけでなく、表面張力の計算や界面の揺らぎまで解説されています。

他の自己組織化の統計力学についても詳しく解説されているので、核内構造体の研究をしていて、理論にも興味がある方にはお勧めです。

ただ、絵は少なめで、数式多めです（物理の本は大体そうです）。

土井正男先生のソフトマター物理学もとても良い本で、相分離もわかりやすく解説されています[10,11]。

こちらも統計力学は既知のものと扱われていますが、ソフトマター物理学の基礎は習得できると思います。

土井先生の本の良いところは、ソフトマターのダイナミクスを扱うのに非常に便利なオンサーガーの変分原理が詳しく解説されている点です。

オンサーガーの変分原理を使って、相分離ダイナミクス（つまり、相分離がどのように進んでいくかということ）を記述する式も導出することができます。

土井先生の本には、相分離ダイナミクスについても必要最低限のことが解説されています。

小貫明先生の本[12,13]とHohenbergとHalperinの総説[14]には、相分離ダイナミクスについて詳しく解説されていますが、難易度は高めです。

Flory-Hugginsの理論は、土井先生の本にかなり易しく解説されています[10,11,13]。

de Gennesの本[15]やRubinstein先生の本[16]を参照してもよいでしょう。

どの本を参照されても、Flory-Hugginsの理論の解説はさほど変わりません。

arcRNAによる核内構造体形成の物理

高分子物理学の立場から考えるarcRNAの役割

核内構造体の中には、arcRNAを足場とするものがあります。

arcRNAはRNA結合タンパク質（RBP）とのRNP複合体を形成しますが、RBPの間の多価相互作用によってこれらの核内構造体が形成されることをお話ししました。

また、arcRNAは転写によって生成されますが、それは系を絶えず熱平衡状態からずらすために、スタンダードな原理が使えないので核内構造体（特にRNAを足場とするもの）は面白いという話もしました。

arcRNAが生成されていなくてもRBPは核内にありますが、RBPだけでは核内構造体は作られないようです。

それでは、arcRNAはどのような働きをしているのでしょうか。

この記事をここまで読んでくれた方は、すでにお気づきになったかもしれません。

一般的に、1本の長いarcRNAには、複数のRBPが結合します。

arcRNAは複数のRBPを実効的につなげているわけです[17]。

つながっていると、一緒にしか動けないのでエントロピーの寄与が小さくなり、相分離しやすくなるということがFlory-Huggins理論の骨子でした。

arcRNAは複数のRBPをつなげることによって相分離しやすくするわけですね。

非平衡物理の立場から考えるarcRNAの役割

arcRNAは転写によって生成されるので、転写サイト付近で濃度（体積分率）が高くなり、濃度勾配が形成されます。

転写サイト付近でarcRNAの濃度（体積分率）が高くなることも、RNP複合体間の多価相互作用を増幅し、相分離しやすくします[17]。

ArcRNAが高分子であることと(高分子性)、転写によって生成されるために非平衡状態であること（非平衡性）のために、核内構造体の足場になることができるのです。

arcRNAによる核内構造体形成の基礎理論

相分離が起きている間の分子（または、その体積分率）の運動を相分離ダイナミクスと言います。

相分離ダイナミクスは、Cahn-Hillard（カーン―ヒリヤード）方程式によって記述されます[10-13]。

私は、arcRNAが核内構造体形成の足場となる原因がその高分子性と非平衡性にあると考え、arcRNAとRBPの結合（RNP複合体の形成）と転写によるarcRNAの生成を考えてCahn-Hillard方程式を拡張し、核内構造体形成を記述する基礎方程式を求めました。

この方程式を解くと、転写によって凝集体が形成されることを示すことができて、その大きさを予言することもできます。

この理論によって、凝集体の半径は、転写レートの1/3乗に比例して大きくなることが分かりました。

パラスペックルという核内構造体は、そのarcRNAの両末端を切ってやると、液液相分離のようなふるまいを示します。

転写量を増加させると、その変異体パラスペックルが大きくなることが実験的に観察されています[18]。

まだ定性的なチェックにとどまっていますが、今のところ矛盾した実験結果はないとおもいます。

参考文献

1.S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman & M. K. Rosen, “Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry”, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 18: 285–298 (2017). doi: https://doi.org/10.1038/nrm.2017.7

2.Y. Shin & C. P. Brangwynne, “Liquid phase condensation in cell physiology and disease”, Science, 357: eaaf4382 (2017). doi: https://doi.org/10.1126/science.aaf4382

3.A. G. Larson, D. Elnatan, M. M. Keenen, M. J. Trnka, J. B. Johnston, A. L. Burlingame, D. A. Agard, S. Redding & G. J. Narlikar, “Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin”, Nature, 574: 236–240 (2017). doi: https://doi.org/10.1038/nature22822

4.A. R. Strom, A. V. Emelyanov, M. Mir, D. V. Fyodorov, X. Darzacq & G. H. Karpen, “Phase separation drives heterochromatin domain formation”, Nature, 547: 241–245 (2017). doi: https://doi.org/10.1038/nature22989

5.T. Chujo, T. Yamazaki, & T. Hirose, “Architectural RNAs (arcRNAs): A class of long noncoding RNAs that function as the scaffold of nuclear bodies”, Biochim. Biphys. Acta, 1859: 139-146 (2016). doi: https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2015.05.007

6.P. J. Flory, “Thermodynamics of High Polymer Solutions”, J. Chem. Phys., 10: 51–61 (1942). doi: https://doi.org/10.1063/1.1723621

7.M. L. Huggins, “Thermodynamic properties of solutions of long-chain compounds”, Ann. New York Acad. Sci., 43: 1-32 (1942). doi: https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.1942.tb47940.x

8.久保亮五、「新装版　統計力学」、共立出版、2003.

9.S. A. Safran, Statistical thermodynamics of surfaces, interfaces, and membranes, Westview Press, 2003. Amazonで購入

10.M. Doi, Soft Matter Physics, Oxford, 2013. Amazonで購入

11. 土井正男、ソフトマター物理学入門、岩波、2019. Amazonで購入

12.A. Onuki, Phase transition dynamics, Cambridge Univ. Press, 2007. Amazonで購入

13.土井正男 & 小貫明、「高分子物理・相転移ダイナミクス」、岩波、2018. Amazonで購入

14.Hohenberg & Halperin, Theory of dynamic critical phenomena, Rev. Mod. Phys., 49, 435 (1977). doi: https://doi.org/10.1103/RevModPhys.49.435

15.P. G. de Gennes, “Scaling concepts in polymer physics”, Conell Univ. Press, 1979.

16. M. Rubinstein & R. Colby, “Polymer Physics”, Oxford Univ. Press, 2003.

17. T. Yamamoto, T. Yamazaki, & T. Hirose, “Phase separation driven by production of architectural RNA transcripts”, Soft Matter, 16: 4692-4698 (2020). doi: https://doi.org/10.1039/C9SM02458A

18.T. Yamazaki, T. Yamamoto, H. Yoshino, S. Souquere, S. Nakagawa, G. Pierron & T. Hirose, “Paraspeckles are constructed as block copolymer micelles”, EMBO J., 40: e107270 (2021). doi: https://doi.org/10.15252/embj.2020107270

山本哲也

キンメダイ美術館のサイエンティスト

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電子工学で学位を取得後、理論物理学者になるため、ドイツ、イスラエル、中国で修行。現在は、習得した理論物理学を使って遺伝子発現制御のメカニズムを明らかにする研究をしています。研究だけでなく、趣味やいろいろ考えていることなどお話ししたいと思います。